三代測序
三代測序簡(jiǎn)介
【添加時(shí)間:2016-09-05 09:17:49】【來(lái)源:】【作者:dggadmin】
       第三代測序技術(shù)是指單分子測序技術(shù)。測序不需要經(jīng)過(guò)PCR擴增,實(shí)現了對每一條DNA分子的單獨測序。主要代表為美國Pacific Bioscience公司的SMRT技術(shù)。脫氧核苷酸用熒光標記,顯微鏡可以實(shí)時(shí)記錄熒光的強度變化。當熒光標記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時(shí)候,其熒光就同時(shí)能在DNA鏈上探測到。當它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時(shí)候,熒光基團就被DNA聚合酶切除,熒光消失。這種熒光標記的脫氧核苷酸不會(huì )影響DNA聚合酶的活性,并且在熒光被切除之后,合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。最新推出的Sequel單分子測序平臺保留了PacBio RS II長(cháng)讀取、均一覆蓋和甲基化信息的優(yōu)勢,其測序通量是后者的7倍。
\
圖1:PacBio RS II 測序儀

\
圖2:PacBio Sequel測序儀
\
圖3: SMRT技術(shù)建庫流程

     第三代測序的技術(shù)特點(diǎn)是:
1、實(shí)現了DNA聚合酶內在自身的反應速度,一秒可以測10個(gè)堿基,測序速度是化學(xué)法測序的2萬(wàn)倍。
2、實(shí)現了DNA聚合酶內在自身的延續性,一個(gè)反應就可以測非常長(cháng)的序列(可以測幾千個(gè)堿基。
3、精度非常高,達到99.9999%。
4、直接測RNA的序列。以RNA為模板復制DNA的逆轉錄酶也同樣可以。RNA的直接測序,將大大降低體外逆轉錄產(chǎn)生的系統誤差。
5、第二個(gè)是直接測甲基化的DNA序列。DNA聚合酶復制A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板,DNA聚合酶停頓的時(shí)間不同。根據這個(gè)不同的時(shí)間,可以判斷模板的C是否甲基化。

      第三代測序的應用主要有三個(gè)方面:
      1. 基因組測序
由于具有讀長(cháng)長(cháng)的特點(diǎn),SMRT測序平臺在基因組測序中能降低測序后的Contig數量,明顯減少后續的基因組拼接和注釋的工作量,節省大量的時(shí)間。
       2. 甲基化研究
       SMRT技術(shù)采用的是對DNA聚合酶的工作狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)監測的方法,聚合酶合成每一個(gè)堿基,都有一個(gè)時(shí)間段,而當模板堿基帶有修飾時(shí),聚合酶會(huì )慢下來(lái),使帶有修飾的堿基兩個(gè)相鄰的脈沖峰之間的距離和參考序列的距離之間的比值如果大于1,由此就可以推斷這個(gè)位置有修飾。通過(guò)聚合酶動(dòng)力學(xué)提供的信息,可直接檢測到DNA甲基化,包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶(5-mC)和5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC),為表觀(guān)遺傳學(xué)研究打開(kāi)了一條通路。
       3. 突變鑒定 (SNP檢測)

       單分子測序的分辨率具有不可比擬的優(yōu)勢,而且沒(méi)有PCR擴增步驟,就沒(méi)有擴增引入的堿基錯誤,該優(yōu)勢使其在特定序列的SNP檢測,稀有突變及其頻率測定中大顯身手。

\
圖4 用三代測序技術(shù)研究細菌基因組和甲基化組



上一篇:第一頁(yè)
下一篇:最后一頁(yè)