環(huán)境微生物測(cè)序分析
微生物群落多樣性--擴(kuò)增子測(cè)序
【添加時(shí)間：2016-07-20 14:13:08】【來源：】【作者：weiliang】
環(huán)境樣品的單基因擴(kuò)增子測(cè)序，主要是利用HiSeq/MiSeq平臺(tái)對(duì)原核16S rRNA、真菌18S rRNA、真菌ITS、功能基因擴(kuò)增子測(cè)序?？蛻糁恍枰峁└哔|(zhì)量的DNA樣品，由專業(yè)人員進(jìn)行PCR擴(kuò)增及上機(jī)測(cè)序，獲得環(huán)境樣品中單個(gè)基因的組成和多樣性信息。
16S rRNA是目前最常用的生物標(biāo)志物，廣泛應(yīng)用于微生物的系統(tǒng)進(jìn)化、分類及多樣性研究中。16S rRNA占細(xì)菌總RNA量的80%以上，基因序列長(zhǎng)短適中，其結(jié)構(gòu)中既有保守區(qū)域，又有變異區(qū)域，是較好的生物標(biāo)志物。人們根據(jù)16S rRNA基因不同區(qū)域序列的可變性將其分為9 個(gè)可變區(qū)和9 個(gè)保守區(qū)（圖1）
擴(kuò)增子測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程如下：
擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)分析方法見“生物信息學(xué)服務(wù)”。
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16S rRNA是目前最常用的生物標(biāo)志物，廣泛應(yīng)用于微生物的系統(tǒng)進(jìn)化、分類及多樣性研究中。16S rRNA占細(xì)菌總RNA量的80%以上，基因序列長(zhǎng)短適中，其結(jié)構(gòu)中既有保守區(qū)域，又有變異區(qū)域，是較好的生物標(biāo)志物。人們根據(jù)16S rRNA基因不同區(qū)域序列的可變性將其分為9 個(gè)可變區(qū)和9 個(gè)保守區(qū)（圖1）
圖1 16S rRNA 基因保守區(qū)和可變區(qū)的分布
擴(kuò)增子測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程如下：
1. 基因組DNA提取
不同樣品性質(zhì)不一樣，提取DNA的方法會(huì)有差異。對(duì)于土壤DNA提取，推薦使用PowerSoil® DNA Isolation Kit，該試劑盒也可以提取糞便、腸道內(nèi)容物等樣品。
2. PCR
根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)帶barcode的引物，以DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
3. PCR產(chǎn)物純化和定量
PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，然后定量產(chǎn)物濃度。按照每個(gè)樣品的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。
4. 文庫(kù)構(gòu)建及上機(jī)測(cè)序
根據(jù)產(chǎn)品說明書構(gòu)建文庫(kù)，并上機(jī)測(cè)序。
擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)分析方法見“生物信息學(xué)服務(wù)”。
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